感覺態(tài)細胞的特點：
1.限制缺陷型：外切酶和內(nèi)切酶活性缺失，外源基因進入后可穩(wěn)定存在。
2.感染缺陷型：防止重組細胞擴散污染。
3.重組整合缺陷型：外源基因進入后游離在染色體外，不會發(fā)生重組。
4.高轉(zhuǎn)化率：易接受外源核酸。
5.遺傳互補：與載體有選擇標記互補的表型，能夠篩選。
感覺態(tài)細胞的實驗步驟：
（1）感受態(tài)細胞的制備
1）挑取大腸桿菌劃線于LB平板上，在37℃恒溫培養(yǎng)過夜(16-18h)。
2）挑取單菌落于50mLLB培養(yǎng)基中37℃、200r/min培養(yǎng)3-4h，至出現(xiàn)薄霧狀菌懸液即可。
3）將培養(yǎng)液置于冰上預(yù)冷15min，并間斷輕輕搖動。
4）將冷卻的培養(yǎng)液倒入己在冰上預(yù)冷的50mL離心管中。
5）在冷凍離心機中離心，4℃3000r/min離心5min。
6）棄上清、加入15mL冰上預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液,輕輕旋轉(zhuǎn)，使細胞充分重新懸浮，冰上放置20-30min。
7）于4℃3000r/min離心5min。
8）棄上清，加入2mL冰上預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液，輕輕旋轉(zhuǎn)，使細胞充分重新懸浮，5min后就可以用于轉(zhuǎn)化實驗，或添加保護劑，低溫或超低溫冷凍貯藏備用。
（2）感覺態(tài)細胞的DNA轉(zhuǎn)化
1）將-80℃保存的細胞置于冰中融化10分鐘。
2）取細胞移至新的轉(zhuǎn)化管中。向細胞中加入0.1ng～10ng（3µl～10µl）的轉(zhuǎn)化用DNA，輕輕混勻后冰中放置30分鐘。
3）42℃水浴中放置45秒鐘后，立即于冰中放置1～2分鐘。
4）加入890µl37℃預(yù)溫的SOC培養(yǎng)基，在37℃200r/min振蕩培養(yǎng)50-60min,使細菌復(fù)蘇，抗性得以表達。
5）取100μL左右轉(zhuǎn)化液涂布在含有4μLIPTG，40μLx-ga1和氨芐青霉素(Amp50μg/mL)的平板上。
6）倒置平板于37℃培養(yǎng)16-18h，觀察實驗結(jié)果并記錄。
滬ICP備14030958號-14 管理登陸 技術(shù)支持：化工儀器網(wǎng) GoogleSitemap